所謂基因遞送系統，指的是一套能(néng)将基因片段定向投送到特定器官、組織和細胞中(zhōng)的系統。對于很(hěn)多(duō)疾病的預防和治療來說，一套精(jīng)确和高效的基因遞送系統往往起到關鍵的作(zuò)用(yòng)。

如果一種疾病的發生是因為(wèi)人體(tǐ)中(zhōng)某個重要基因出現了缺陷，例如很(hěn)多(duō)單基因遺傳病，那麽如果利用(yòng)基因遞送系統将正常基因序列送入這些細胞，就有(yǒu)可(kě)能(néng)徹底治愈這些疾病。相反，也有(yǒu)不少疾病可(kě)能(néng)和某種基因的過度活躍相關，這個時候如果能(néng)利用(yòng)基因遞送系統将幹擾該基因表達的工(gōng)具(jù)送入細胞，例如CRISPR/cas9等基因編輯工(gōng)具(jù)，也有(yǒu)可(kě)能(néng)起到釜底抽薪的效果。

目前已經被深入開發和廣泛利用(yòng)的基因遞送系統的種類繁多(duō)，但主流大概是這麽兩大類：基于脂質(zhì)體(tǐ)納米顆粒（LNP，lipid nanoparticles）的遞送系統，和基于病毒的遞送系統。下面我們将會簡單介紹下兩套系統。

我們先說基于LNP的遞送系統。這套系統在新(xīn)冠大流行之後變得廣為(wèi)人知，因為(wèi)大流行中(zhōng)使用(yòng)最為(wèi)廣泛的幾款mRNA疫苗使用(yòng)的都是這套遞送系統。其工(gōng)作(zuò)原理(lǐ)簡單來說就是，将編碼新(xīn)冠病毒刺突蛋白的RNA片段包裹在空心的脂質(zhì)體(tǐ)納米顆粒中(zhōng)，再注射入人體(tǐ)，這些納米顆粒就可(kě)以和人體(tǐ)細胞融合，将RNA片段送入人體(tǐ)細胞并生産(chǎn)刺突蛋白，從而激發人體(tǐ)對新(xīn)冠病毒的免疫記憶。

可(kě)想而知，這套基因遞送系統的用(yòng)途當然不僅僅是新(xīn)冠，目前已經有(yǒu)多(duō)家公(gōng)司利用(yòng)這一技(jì )術路線(xiàn)開發針對其他(tā)病原體(tǐ)的疫苗，例如流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、帶狀疱疹病毒（VZV）、巨細胞病毒（CMV）等。不少産(chǎn)品已經進入了臨床試驗階段[1]。

除了開發疫苗，基于LNP的基因遞送系統還有(yǒu)更廣泛的想象空間。例如Moderna公(gōng)司也試圖用(yòng)LNP遞送系統将編碼細胞因子白介素12（IL-12, interleukin-12）的RNA片段投送到腫瘤組織内部，讓腫瘤細胞生産(chǎn)和分(fēn)泌IL-12，刺激腫瘤微環境中(zhōng)的免疫反應，起到殺傷腫瘤的作(zuò)用(yòng)[2]。2021年，Intellia公(gōng)司也使用(yòng)LNP遞送系統，治療一種先天單基因遺傳病，轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性。他(tā)們将靶向人體(tǐ)TTR基因的CRISPR/cas9基因編輯工(gōng)具(jù)投送到患者肝髒中(zhōng)，破壞其體(tǐ)内過度活躍的TTR基因表達，且觀察到了顯著且持續的臨床效果[3]。

我們再說說基于病毒的基因遞送系統。這其實是一個很(hěn)古老的思路，人們很(hěn)早就意識到病毒在感染宿主細胞的時候會将病毒内部的遺傳物(wù)質(zhì)送入宿主細胞中(zhōng)，這些來自病毒的基因片段會在宿主細胞内啓動蛋白質(zhì)生産(chǎn)并參與新(xīn)一代病毒顆粒的組裝(zhuāng)。

以我們都非常熟悉的新(xīn)冠病毒為(wèi)例，在它感染宿主細胞後，新(xīn)冠病毒内部包裹的一條由大約3萬個堿基組成的單鏈RNA分(fēn)子也會随之進入細胞，這條單鏈RNA分(fēn)子編碼了多(duō)種蛋白質(zhì)，其中(zhōng)既有(yǒu)新(xīn)冠病毒的重要結構單元例如病毒表面的刺突蛋白，也有(yǒu)參與新(xīn)冠病毒複制的重要蛋白，例如RNA聚合酶。那麽既然如此，如果對天然的病毒加以改造，将人們希望遞送的基因片段放進病毒基因組序列之中(zhōng)，自然就可(kě)以實現特定基因的定向投送。

早在人類第一次嘗試基因治療——也就是将特定基因片段送入因基因缺陷而導緻的疾病患者體(tǐ)内時，使用(yòng)的就是經過改造的病毒載體(tǐ)。在1990年代，研究者們使用(yòng)逆轉錄病毒（Retrovirus）将完整的腺苷脫氨酶基因（ADA，adenosine deaminase）導入患者的免疫細胞中(zhōng)，用(yòng)于挽救患者免疫細胞的功能(néng)，治療先天性的重症聯合免疫缺陷症（SCID）[4]。最早接受這種治療的一位患者在10年回訪中(zhōng)仍然有(yǒu)多(duō)達20%的淋巴細胞在持續表達ADA基因，并且得以維持基本健康的生活[5]

一直到今天，人們仍然在廣泛的使用(yòng)各種病毒遞送系統用(yòng)于治療疾病。目前歐美市場上獲批的基因治療産(chǎn)品，絕大多(duō)數都是基于病毒載體(tǐ)的。例如Bluebird Bio公(gōng)司的産(chǎn)品Zynteglo，利用(yòng)慢病毒（Lentivirus）載體(tǐ)治療地中(zhōng)海貧血症；諾華公(gōng)司的Zolgensma，利用(yòng)腺相關病毒（AAV，adeno-assciated virus）治療脊髓性肌萎縮症（SMA）；PTC Therapeutics公(gōng)司的Upstaza，利用(yòng)AAV載體(tǐ)治療芳香族 L-氨基酸脫羧酶缺乏症(AADC)；等等。目前還在臨床開發中(zhōng)的其他(tā)類别的病毒載體(tǐ)也有(yǒu)不少。例如Krystal Therapeutics公(gōng)司利用(yòng)單純疱疹病毒載體(tǐ)（HSV-1），将7型膠原蛋白基因投送到患者皮膚組織中(zhōng)，治療因該基因缺陷導緻的隐性營養不良性大疱性表皮松解症（RDEB），在臨床試驗中(zhōng)取得了很(hěn)不錯的療效[6]

那麽這些基因遞送系統有(yǒu)沒有(yǒu)什麽潛在的技(jì )術問題呢(ne)？

當然有(yǒu)，這些運載工(gōng)具(jù)本身的毒副作(zuò)用(yòng)就是非常值得重視的問題。LNP載體(tǐ)往往有(yǒu)較強的免疫原性，例如新(xīn)冠mRNA疫苗注射後往會引起很(hěn)大比例的發燒、疲勞、注射部位疼痛等副作(zuò)用(yòng)。病毒載體(tǐ)也有(yǒu)可(kě)能(néng)激發強烈的免疫反應。例如1999年，一位年輕患者在接受基于腺病毒載體(tǐ)的基因治療後引發強烈免疫反應并死亡，對整個基因治療領域都産(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響[7]。另外，一部分(fēn)病毒載體(tǐ)（例如逆轉錄病毒和慢病毒）在感染人體(tǐ)細胞後，會将自身基因片段插入宿主細胞的基因組DNA上，存在一定破壞宿主基因組結構完整性的風險。

而更為(wèi)關鍵的是，在臨床開發中(zhōng)，LNP也好，病毒載體(tǐ)也好，用(yòng)來做基因遞送都面臨一個相同的技(jì )術難題：如何提高基因遞送的靶向性。就是如何保證能(néng)把特定的基因片段投送到特定組織和器官、特定的細胞類型中(zhōng)，盡量避免對其他(tā)無關組織、器官和細胞類型的幹擾。

LNP的構成是各種脂類分(fēn)子（包括可(kě)電(diàn)離脂質(zhì)、膽固醇、磷脂和聚乙二醇化脂質(zhì)分(fēn)子等）。在血液中(zhōng)LNP很(hěn)容易和專門結合脂類分(fēn)子的載脂蛋白（ApoE, apolipoprotein E）結合，并被運載到肝髒。這也是為(wèi)什麽大多(duō)數LNP藥物(wù)會傾向于在肝髒中(zhōng)富集。

想要改變這種傾向性，一個思路是改變LNP的脂類分(fēn)子構成。例如2020年有(yǒu)研究發現，在LNP中(zhōng)添加某些帶有(yǒu)正/負電(diàn)荷的脂類分(fēn)子，可(kě)以改變LNP表面的電(diàn)化學(xué)特性，實現對肺部、脾髒、肝髒、肌肉等器官的一定程度的傾向性[8] [9]。另一個技(jì )術思路則是，在LNP上插入本身就具(jù)備細胞靶向性的分(fēn)子标記，為(wèi)LNP賦予更精(jīng)确的投送能(néng)力。例如在LNP表面連接上專門識别CD4蛋白的抗體(tǐ)，就能(néng)将LNP定點投送到T細胞附近，因為(wèi)這些T細胞表面存在大量的CD4蛋白[10]。2023年1月發表的一項研究中(zhōng)，也有(yǒu)研究者們篩選得到了一個能(néng)夠專一結合視網膜感光細胞的肽段，将其插入LNP表面，就能(néng)實現LNP對視網膜感光細胞的靶向性投送[11]。

而針對病毒的改造方式就更為(wèi)豐富。作(zuò)為(wèi)天生的入侵者，病毒感染宿主細胞的過程，本身就具(jù)備一定的特異性：簡單來說就是特定病毒往往隻能(néng)感染特定生物(wù)的特定細胞類型。

例如我們非常熟悉的人類免疫缺陷病毒（HIV），就能(néng)夠專一感染人體(tǐ)特定種類的淋巴細胞。這是因為(wèi)HIV入侵宿主細胞需要借助這些淋巴細胞表面的兩個特征性蛋白質(zhì)，CD4和CCR5[12]。事實上一種治療艾滋病的思路就是利用(yòng)基因編輯手段破壞人體(tǐ)免疫細胞的CCR5基因，從而阻止HIV的感染[13]。類似的，新(xīn)冠病毒感染人體(tǐ)細胞的過程，也依賴于新(xīn)冠病毒表面的刺突蛋白與人體(tǐ)細胞表面的ACE2蛋白的結合[14]。

既然病毒天然就具(jù)備細胞類型的精(jīng)确靶向性，那麽我們自然可(kě)以想到，通過挑選合适的病毒，或者對已有(yǒu)的病毒載體(tǐ)進行改造，就有(yǒu)可(kě)能(néng)讓它們精(jīng)确靶向某一類我們所期待的細胞類型。

這方面進展最多(duō)的，可(kě)能(néng)是對AAV病毒載體(tǐ)的改造。AAV因其較低的免疫原性和成熟的生産(chǎn)工(gōng)藝，被普遍看作(zuò)是最有(yǒu)前途的基因遞送系統之一。天然存在的AAV載體(tǐ)因血清型不同已經體(tǐ)現出了一定程度（但很(hěn)有(yǒu)限）的器官選擇性，例如AAV1對肌肉組織、AAV8對肝髒、AAV9對肝髒、肺、和大腦組織等。但很(hěn)多(duō)研究者預計，如果對AAV病毒的衣殼特征進行改造和篩選，有(yǒu)可(kě)能(néng)實現更精(jīng)确的靶向性。例如，通過對AAV表面蛋白質(zhì)序列進行定向進化和篩選，研究者們發現了能(néng)夠定向感染中(zhōng)樞神經系統和周圍神經系統的新(xīn)病毒載體(tǐ)[15][16]。利用(yòng)類似思路，研究者們也開發出了能(néng)夠感染大腦中(zhōng)一群特定的免疫細胞——小(xiǎo)膠質(zhì)細胞——的AAV載體(tǐ)[17]。在其他(tā)組織類型中(zhōng)，例如肌肉細胞[18]、内耳細胞[19]、T淋巴細胞[20]等等，近年來也有(yǒu)非常不錯的研究進展。

上述進展主要依賴于對病毒進行大規模的随機突變和反複篩選。而最近也有(yǒu)一項研究通過對病毒載體(tǐ)進行定向改造實現了對肌肉細胞的定向投送[21]，展示了一種全新(xīn)的改造病毒載體(tǐ)的思路。

簡而言之，這項研究利用(yòng)了肌肉細胞一個天然屬性：骨骼肌細胞在發育過程中(zhōng)是獨立的細胞，但在發育完成後會彼此融合形成粗大的肌纖維。這種細胞融合的過程依賴于肌肉細胞表面的特定融合蛋白，如Myomaker和Myomerger。一個有(yǒu)趣的聯想是，肌肉細胞之間的融合，和有(yǒu)包膜病毒對宿主細胞的入侵，兩個迥然不同的生物(wù)學(xué)過程卻都涉及到細胞膜的融合過程。研究者們因此想到，如果把這些肌肉細胞融合蛋白插入有(yǒu)包膜病毒的表面，也能(néng)夠促進病毒載體(tǐ)和肌肉細胞的融合，實現對肌肉細胞的靶向投送。他(tā)們根據這個思路對慢病毒進行了改造，果然實現了對肌肉組織的高效識别和投送。

我們剛剛描述的基因遞送系統，主要的運輸對象是DNA/RNA這些核酸分(fēn)子，這些核酸分(fēn)子進入目的細胞後再生産(chǎn)對應的蛋白質(zhì)。需要注意的是，直接将蛋白質(zhì)分(fēn)子投送到特定細胞内，往往也能(néng)實現類似的目的。

近年來，也已經有(yǒu)一些蛋白質(zhì)投送工(gōng)具(jù)被開發出來。一個特别值得注意的方向仍然是利用(yòng)病毒載體(tǐ)。這個技(jì )術路線(xiàn)的邏輯很(hěn)簡單，将需要投送的蛋白質(zhì)分(fēn)子直接連接在病毒顆粒中(zhōng)某個蛋白質(zhì)分(fēn)子的末端即可(kě)。例如在2022年，哈佛大學(xué)David Liu實驗室将單堿基基因編輯工(gōng)具(jù)蛋白通過一個肽段連接在逆轉錄病毒MMLV顆粒中(zhōng)，當類病毒顆粒進入宿主細胞後，堿基編輯工(gōng)具(jù)被釋放出來，可(kě)以對宿主細胞的特定基因進行編輯[22]。

在2023年3月，布羅德(dé)研究所張鋒實驗室開發了一套全新(xīn)的蛋白質(zhì)遞送系統，這套系統具(jù)備了精(jīng)确靶向性的巨大潛力[23]。這套全新(xīn)遞送系統的學(xué)習對象不是病毒，而是細菌。更精(jīng)确的說，是很(hěn)多(duō)細菌中(zhōng)存在的可(kě)收縮注射系統（eCIS，extracellular contractile injection system）。

我們可(kě)以吧細菌的eCIS系統看成是一套細菌生産(chǎn)和釋放的微型注射器，其外形是大約100納米長(cháng)、可(kě)收縮的針管狀結構。細菌在入侵和感染宿主的時候，可(kě)以批量釋放這些微型注射器，它們可(kě)以結合在宿主細胞膜上，刺破細胞膜，将針管内部的蛋白質(zhì)注射到細胞内部，幹擾細胞的生存和活動，為(wèi)細菌入侵和繁殖提供幫助[24]。

張鋒實驗室就試圖改造和利用(yòng)這套天然存在的蛋白質(zhì)投送系統。他(tā)們将發光杆菌中(zhōng)負責制造eCIS的完整基因序列（包含16個基因，pvc1-16）導入大腸杆菌中(zhōng)，從而批量生産(chǎn)和組裝(zhuāng)出這種微型注射器。當然，想要這套系統發揮作(zuò)用(yòng)，真正重要的是是否能(néng)對它進行兩個方面的改造：是否可(kě)以随意替換eCIS的投送蛋白，以及是否可(kě)以改造eCIS以實現對特定細胞類型的投送。

首先研究者們證明，這種微型注射器具(jù)體(tǐ)注射什麽蛋白質(zhì)進入細胞，确實是可(kě)以人為(wèi)改造的。隻需要eCIS基因序列上編碼被投送蛋白的相應片段，更換為(wèi)需要被投送的蛋白質(zhì)基因序列即可(kě)，例如基因編輯工(gōng)具(jù)cas9，綠色熒光蛋白GFP，重組蛋白Cre等等。

其次，研究者們發現eCIS的其中(zhōng)一個組成部分(fēn)，pvc13蛋白，可(kě)能(néng)和微型注射器對宿主的識别相關。這個蛋白位于微型注射器的針頭位置附近，直接和宿主細胞表面相接觸。因此，如果改造pvc13蛋白的構造，讓它能(néng)結合特定細胞類型的表面蛋白質(zhì)，也許就可(kě)以實現eCIS的細胞靶向性。例如，如果在pvc13蛋白上接上一個能(néng)夠結合人體(tǐ)細胞表面EGFR蛋白的肽段，改造後的微型注射器就可(kě)以結合人體(tǐ)細胞，并将注射器内部的蛋白質(zhì)注射進入人體(tǐ)細胞内部。

在上述兩層改造完成後，細菌天然存在的eCIS系統就被升級成了一套能(néng)夠定向向特定細胞注射特定蛋白質(zhì)分(fēn)子的基因遞送系統。研究者們還進一步證明了這套系統還能(néng)在小(xiǎo)鼠體(tǐ)内（包括大腦中(zhōng)）發揮功能(néng)。

相比投送DNA/RNA基因片段，直接投送蛋白質(zhì)分(fēn)子的一個潛在好處是，蛋白質(zhì)分(fēn)子進入細胞後往往會被快速降解，在細胞内存在和發揮功能(néng)的時間有(yǒu)限，可(kě)能(néng)可(kě)以避免對細胞功能(néng)長(cháng)時間的幹擾和破壞。因此我們可(kě)以想象，在不同的應用(yòng)場景下，DNA/RNA遞送系統和蛋白質(zhì)遞送系統可(kě)能(néng)會體(tǐ)現不同的獨特價值。

在這裏請允許我稍作(zuò)總結：很(hěn)多(duō)人類疾病都和特定基因的缺陷或過度活躍直接相關，因此如果能(néng)利用(yòng)基因遞送系統，直接操縱這些基因的開關，将能(néng)夠幫助我們直接幹預和治療這些疾病。而因為(wèi)這些緻病基因的活動幾乎總是具(jù)有(yǒu)時空特異性——也就是隻在特定時間、特定細胞類型中(zhōng)發揮作(zuò)用(yòng)，因此基因遞送系統也相應的需要具(jù)備操控的時空精(jīng)确性。

不管是基于LNP、基于病毒載體(tǐ)、還是基于eCIS的基因遞送系統，在這些方面都還大有(yǒu)潛力可(kě)挖，大有(yǒu)機會可(kě)以抓住。

 參考資料